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Mutación Sitio dirigida en Escherichia coli Por intercambio Alélico vía producto de PCR

Cuando se trabaja con genética, siempre es notable y bienvenido poder mutar o interrumpir sitio dirigidamente un gen. Ya que así podemos saber  que función especifica cumple este, por pérdida o ganancia de alguna función. Hasta hoy se han logrado hacer trabajos en levaduras, y bacterias como E. coli o S. typhi obteniendo notables resultados y reduciendo un gran porcentaje de dolores de cabeza en la vida a miles de científicos en el mundo.

Todo se basa en las siguientes herramientas genéticas ocupadas en el orden descrito.

1.A 

En primer lugar tenemos que tener claro, que lo que se pretende con esta estrategia es hacer recombinación homologa a nivel cromosomal con un fragmento lineal de DNA (producto de PCR).

Para lograr este objetivo lo primero que tenemos que hacer ingresar a nuestra bacteria es el siguiente plásmido.

Este Plásmido expresa los genes del Fago λ Red que nos ayuda por las siguientes características.

 

• Lo primero es que estas proteínas inhiben las DNAasas permitiéndonos mantener mas tiempo   nuestros fragmentos lineales.
• por otra parte proteínas que facilitan la recombinación homologa.
• Tiene un ori termo sensible y de bajo número de copias, lo que nos ayuda a regular hasta que punto tenemos el plásmido dentro de nuestra bacteria.
• Posee un promotor inducible por arabinosa lo que nos permite expresar  a nuestra disposición los genes y así no generar mutaciones inespecíficas y no deseadas.

 

Ya con esto podemos ingresar nuestro fragmento lineal a la bacteria y que no se degrade al interior de ella!

 

1.B

 

Ahora bien! ¿Como podemos obtener este fragmento lineal  mediante un PCR?

 Como saben (si es que saben) dentro de la receta de un PCR tenemos:

  

• DNA Templado o molde
• Partidores
• nucleótidos
• magnesio
• polimerasa  TAQ  con su respectivo Buffer.

 

 De todos estos componentes los que varían entre un PCR y otro son el DNA templado y los partidores.

Para este caso ocuparemos un plásmido como templado. Este puede ser un pGEM T, o alguno comercial  que se disponga en el laboratorio, solo debemos considerar que este plásmido debe tener una característica necesaria para el desarrollo de esta técnica. Y este requerimiento es un cassette de resistencia, ampicilina por ejemplo (que nos servirá para seleccionar las recombinaciones exitosas posteriormente) delimitado por secuencias o fragmentos FRT (Flip Recombinase Target).

Los partidores por su parte deben diseñarse de manera tal que se cumplan estos 2 requisitos:

                a.- el partidor debe tener una región que delimite  el cassette de resistencia de nuestro plásmido templado ( P1 y P2 ).

                b.- una región que aparee con nuestra región objetivo a mutar ( H1 y H2 ;lo mas importante!! ).

(VER FIGURA AL FINAL DEL POST)

 

Ya listos los partidores y el templado largamos el PCR para obtener nuestro producto de DNA Lineal.

  

 2. 

 

¿ahora como logramos hacer la recombinacion homologa?

 Una vez inducido el promotor por arabinosa se procede a hacer transformar las bacterias con el producto de PCR obtenido anteriormente. Este en teoría debería ubicarse en la región que determinamos como target ( H1 y H2 ) y gracias a las proteínas del fago λ, en esta etapa debiésemos tener algún evento de recombinación homologa.

Para eliminar el plásmido se diluye o pierde en la población bacteriana por termosensibilidad (inactivación de la replicación del plásmido a cierta temperatura) y  se selecciona por la resistencia que posee la inserción.

las bacterias que sobreviven son aquellas que poseen la resistencia cromosomal-mente y que por lo tanto está interrumpido la región TARGET.

 

Ya tenemos bacterias con el gen o región cromosomal blanco interrumpida!  

 

 

3.

 

¿Como eliminamos la resistencia del cromosoma?

Ya interrumpida nuestra región cromosomal, lo optimo seria eliminar esta resistencia de modo interferir lo menos posible con material genético y que a su vez esta interrupción sea  lo mas limpia posible, así podríamos tener una idea real de cómo afecto esta interrupción en el fenotipo de la bacteria.

Eso lo podemos lograr con la incorporación de un nuevo plásmido llamado pCP20 a la bacteria con la que estamos trabajando. Que se caracteriza por tener un promotor inducible para un gen que codifica para la enzima FLP ( Flip recombinase Protein.) esta proteína escinde o corta un fragmento entre dos sitios FRT ( los que integramos al cromosoma ) , dejando como cicatriz un sitio FRT.  También tiene una ori termo sensible para eliminarlo por inactivación de la replicación y un método de selección por plaqueo.

Es así como al inducir la expresión de FLP podremos eliminar la resistencia y podemos hacer una contra selección sobre antibióticos de las bacterias inducidas.

Así ya tendríamos una interrupción sitio dirigida en bacterias mediante el uso de herramientas génicas. 

 

En definitiva se puede resumir con el siguiente diagrama.

 

Una innovadora manera de mejorar el estudio funcional de genes publicada el año 2000,http://www.pnas.org/content/97/12/6640.full y que sin duda alguna a sido un valioso aporte a la dinámica de las líneas de investigación de microbiología!